PCR 实验中出现假阴性(无扩增产物)是什么原因?如何解决?

PCR 实验中出现假阴性(无扩增产物)是什么原因
2023-11-16
来源:

PCR 实验中出现假阴性(无扩增产物)

现象:正对照有条带,样品无条带

可能原因:

· 模板:含有?Taq 酶抑制剂、杂蛋白,模板上样量低或模板降解

· 引物:引物降解,引物设计不合理

· 试剂:酶失活,buffer 不合适

· 反应条件:退火温度高,延伸时间短

解决方法:

· 纯化模板并重新提取,并检测模板是否含有抑制剂

· 重新设计引物并低温保存

· 优化 buffer,摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO(小于 0.3%

· 提高退火温度,增加延伸时间(反应条件参照试剂盒说明书)

PCR 实验中出现假阳性

现象:空白对照出现条带

可能原因:

· 引物设计不适,与目的序列具有同源性

· 试剂污染:水、移液枪等被核酸污染

· 样品间出现交叉污染

解决方法:

· 实验仪器高压灭菌

· 实验试剂(酶除外)高压灭菌,离心管枪头一次性使用

· 规范实验操作

· 假阳性可通过巢式 PCR 解决,或者使用特异性较高的试剂盒扩增

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