各国药典对支原体qPCR检测方法验证的要求

各国药典对支原体核酸扩增检测方法（简称NAT法）的验证要求略有出入，但均要求对最低检出限、特异性和耐用性进行验证。在检测方法上，均要求先做样本的支原体DNA抽提，再进行支原体检测。

越来越多的厂商选择使用商品化的支原体qPCR检测试剂盒。

德国MB公司的支原体qPCR检测试剂盒，被广泛使用。Venor®GeM qEP利用定量、实时PCR (qPCR)快速(约3小时)和可靠的筛选细胞培养上清支原体污染。该试剂盒可与任何类型的实时PCR循环器结合使用，能够检测荧光染料FAM™和HEX™。特点：

①经典法qPCR试剂盒遵循欧洲药典流程要求。

②高特异性，一次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察。

③高灵敏度，MB公司的支原体qPCR检测试剂盒经典法最低检测限可达到≤10CFU/ml。

④MB公司有相应配套的10CFU/100CFU的敏感度测试的标准品，便于方法学验证。

⑤MB公司有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

⑥MB公司有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。

在使用商品化检测试剂盒时，则除了需要试剂盒生产商提供完整的方法学验证数据外，还需要使用者验证试剂盒对其样本的适用性，以及试剂盒表现出预期的性能（例如检测限、耐用性、是否存在与细菌的交叉反应）。这些必须由使用者自己来证明。

在检出限验证中，欧洲药典（简称EP）规定了污染细胞的常见9种支原体，要求NAT如替代培养法，对这9种支原体的检测限需均达到10CFU/ml。其中如果生产中未采用昆虫或植物源材料，可不必检柠檬螺原体（Spiroplasma citri）；如果生产中未使用或暴露于禽源材料，可不必检关节液支原体（M. synoviae）。

日本药典（简称JP）中的验证要求与EP基本一致，但在最低检出限验证中，JP 17未提及鸡败血支原体，但增加了唾液支原体的验证。

最终待验证的支原体物种的选择，在依据药典基础上，还需根据支原体污染风险大小而定。污染风险的影响因素有支原体寄生的宿主细胞的特异性、原材料的来源、产品的应用领域等。

德国MB公司提供有10CFU支原体高敏标准品，可同时用于检测限和耐用性的验证。

在NAT法的特异性验证方面，欧洲药典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸杆菌和链球菌与支原体具有较近亲缘关系，应优先选择进行验证。

至于更具体的验证方案，还需要使用者针对自己的产品以及流程自行设计，德国MB公司也可协助完善。