微生物质控之支原体快速检测方法——qPCR法

支原体是细胞实验室中常见的污染源，据有专家统计约有15%-35%的细胞被支原体污染。造成支原体污染的主要来源有：工作环境污染、操作者本身污染、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染会改变细胞内DNA、RNA及蛋白表达，改变宿主细胞的结构和功能，影响细胞代谢和生长，具有干扰病毒复制的不利影响。
相法规及指导原则

中国药典2020版<3301 支原体检查法>：进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

日本药典（JP）14：提供三种检测方法：1）培养法；2）指示细胞培养法；3）PCR法。

欧洲药典（EP）2.6.7及美国药典（USP）<63>：提供三种检测方法：1）琼脂和肉汤培养法；2）指示细胞培养法；3）核酸扩增技术（NAT）。（经过评估后需与前两种方法有可比性，才可作为替代方法）

FDA：提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。

ICH Q5D：提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。

免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）：对微生物污染和微生物代谢产物/衍生物污染的安全性研究，如真菌、细菌、支原体、病毒、内毒素等进行安全性研究。

细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点：病毒和细胞的载体质量标准应包括支原体等。部分支原体种类对人和动物有致病性，存在一定的生物安全风险，因此，支原体检验也是生物制品行业规定的必检项目。

培养法和指示细胞法在实际应用中，存在检测周期较长的缺点，不满足有效期短的产品或需要快速放行的中间品。德国MB为了寻求既满足法规检测需求，又快速方便的检测方式，开发了支原体检测试剂盒qPCR法。

德国MB支原体qPCR检测试剂盒特点：

①经典法qPCR试剂盒遵循美国药典、欧洲药典和日本药典的流程要求。

②高特异性，一次检测即可涵盖了所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。操作简单，易于观察。

③高灵敏度，MB公司的支原体qPCR检测试剂盒经典法最低检测限可达到≤10CFU/ml。

④MB公司有相应配套的10CFU/100CFU的敏感度测试的标准品，便于方法学验证。

⑤MB公司有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。

⑥MB公司有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。