qPCR(实时荧光定量PCR)中的Ct值(循环阈值)是一个关键参数,它代表了荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。关于qPCR中Ct值的正常范围,可以归纳如下:
一、Ct值的正常范围
染料法qPCR通常Ct值的范围为15-35。
内参Ct值通常在十几,**不要超过20。
目的基因的Ct值一般在十多到二十多,超过30但不超过35也可接受。
二、Ct值与样本中靶标核酸含量的关系
低Ct值(通常在20以下):表示样本中靶标核酸含量较高,检测到的病原体或目标基因的数量较多,荧光信号很快就达到了检测阈值。
中等Ct值(在20到30之间):表示样本中靶标核酸含量中等,检测到的病原体或目标基因数量适中。
高Ct值(在30到35之间):表示样本中靶标核酸含量较低,荧光信号需要更多的PCR循环才能达到检测阈值,说明检测到的病原体或目标基因数量较少。
三、Ct值的解读与实验优化
Ct值小于15:认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值,可能需要重新调整实验条件或检查样本质量。
Ct值大于35:理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义,需要重新考虑实验设计或样本的采集与处理。
重复孔之间的差值:应尽量不超过0.5(有些标准更为严格,要求重复孔间Ct值STD<0.2),以避免实验结果受到干扰,产生假阳性或假阴性。
四、注意事项
当Ct值不可用时,可能是引物问题、模板浓度问题、加样错误或样本本身表达低等原因。这时,可以通过检查溶解曲线、调整模板DNA浓度、重新加样或考虑样本的表达情况来解决问题。
溶解曲线应为单峰且无杂峰,以确保PCR产物的纯度。扩增曲线应平滑且具有平台期,无二次扩增上升曲线,以反映PCR反应的真实情况。
综上所述,qPCR中Ct值的正常范围是15-35,但具体范围可能因实验条件、样本类型和实验目的而有所不同。在解读Ct值时,需要综合考虑实验条件、样本质量和实验结果等多个因素。