在细胞培养过程中，支原体污染是一个常见的问题，它可能对细胞生长和实验结果产生负面影响。因此，及时、准确地检测支原体污染至关重要。以下是一些常用的支原体污染检测方法：
一、观察细胞形态和生长特征
虽然支原体污染在初期可能难以通过肉眼直接观察，但在污染较为严重时，细胞的生长速度可能会减慢，培养基的pH值可能明显变酸，并出现细胞病变。然而，由于这些病变特征与病毒感染相似，因此不能作为准确诊断的依据。此外，支原体在适宜的条件下可以在培养基上形成特有的典型菌落，但这种方法检测时间较长，且敏感性不够高，通常作为其他快速检测方法的辅助手段。
二、PCR法
PCR（聚合酶链反应）法是一种快速、灵敏的检测方法，可以检测多种支原体的污染。该方法通过特定的引物对支原体DNA进行扩增，从而实现对支原体的检测。PCR法取样量少，既可进行细胞检测也可进行细胞上清的检测。它具有实验操作简单、花费时间短及灵敏度高等优点，在绝大多数的实验室均可完成。但需要注意的是，PCR法的成本较高，条件要求严格，有时可能出现假阳性结果。
三、荧光染色法
荧光染色法利用荧光染料结合到支原体DNA的特定区域（如A-T富含区域），从而实现对支原体的检测。被支原体污染的细胞在染色后，可以在细胞核外与细胞周围观察到许多大小均一的荧光小点。这种方法简便、快速，且具有较高的特异性。常用的荧光染料包括Hoechst 33258和DAPI等。对于贴壁细胞可以直接进行荧光染色观察，也可通过转接指示细胞进行培养后染色观察；而悬浮细胞必须接种指示细胞进行检测。指示细胞需本身无支原体污染，且是支原体的敏感宿主，如Vero、NIH3T3、3T6、NRK、MDCK和A549细胞等。
四、电子显微镜观察
电子显微镜（包括扫描电镜和透射电镜）或免疫电镜下对样本进行观察，可以直观地看到支原体的形态和结构。然而，这种方法对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，且敏感性不高。因此，它通常作为样品的后定性检测手段。
五、免疫法
间接免疫荧光法和免疫印迹也是常用的支原体检测方法。这两种方法利用抗原-抗体反应的原理，通过特定的抗体与支原体抗原结合，从而实现对支原体的检测。这两种方法简便、快速、特异性强，如果应用单克隆抗体试剂，效果会更好。此外，酶联免疫吸附法（ELISA）也可用于支原体的检测，该方法基于抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶标记的抗体与支原体抗原结合后产生的颜色变化来判断支原体是否存在。
六、培养法
培养法是支原体检测中的常规方法，广泛用于细胞培养物的质量控制和检验。支原体由于没有细胞壁，形态上呈多形性，在固体培养基上培养能够形成中心高密度、周围低密度的典型的“油煎荷包蛋”状菌落，对于结果的判断清晰准确。但培养法检测时间较长，通常需要数周才能得到结果。
七、其他方法
除了以上几种方法外，还可以采用放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等方法进行检测。这些方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方法进行支原体污染的检测。
在实际应用中，为了确保检测结果的准确性，建议采用两种或两种以上的方法对同一样品进行检测。同时，还应加强预防措施，降低支原体污染的风险。例如规范细胞培养技术、搭配使用预防试剂以及定期检测等。