一、细胞培养的核心目标
细胞培养的本质是在体外为细胞提供一个接近体内的生存环境，使其能够：
1. 存活：保持良好的生理状态。
2. 增殖：在可控条件下稳定生长。
3. 可重复实验：为后续实验（如药物处理、转染、蛋白表达等）提供可靠的细胞模型。
二、细胞培养的基本条件
1. 温度与气体环境
- 温度：哺乳动物细胞一般为 37℃。
- CO₂：常用 5% CO₂，用于维持培养基中碳酸氢盐缓冲体系的 pH（约 7.2–7.4）。
- 湿度：培养箱内保持 95% 左右的湿度，防止培养基蒸发。
2. 培养基与血清
基础培养基（如 DMEM、RPMI-1640、MEM 等）提供：
- 氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等基础营养。
- 酚红作为 pH 指示剂（黄色偏酸，紫色偏碱）。
完全培养基：基础培养基 + 血清 + 必要添加物。
血清的作用：
- 提供生长因子（如 EGF、FGF）。
- 提供贴壁因子，帮助细胞贴附在培养器皿表面。
- 提供载体蛋白（如白蛋白），运输激素、脂质等。
- 缓冲环境变化，提高细胞的稳定性。
在选择血清时，通常关注：
- 批次间稳定性。
- 低内毒素、低溶血。
- 无支原体等微生物污染。
三、无菌操作与生物安全柜
1. 生物安全柜的使用要点
- 操作前用 75% 乙醇擦拭台面。
- 只放置当前实验必需的物品，保持台面整洁。
- 所有操作尽量在安全柜的中层区域进行，避免频繁进出。
- 打开瓶盖时，瓶口朝下倾斜，尽量缩短暴露时间。
- 操作结束后再次用 75% 乙醇擦拭台面。
2. 无菌操作原则
- 动作要轻、慢、稳，减少空气扰动。
- 避免在安全柜内剧烈晃动、讲话时正对操作台。
- 所有接触细胞的液体和耗材必须是无菌的。
四、常用耗材与培养器皿
1. 培养器皿
- T 瓶：T25、T75、T175 等，数字表示培养面积。
- 多孔板：6、12、24、96 孔板，用于不同规模的实验。
- 离心管：15 mL、50 mL，用于细胞收集和重悬。
2. 耗材要求
- 无菌、无热原。
- 贴壁细胞使用 TC-treated（组织培养处理）的器皿，以利于细胞贴附。
五、日常操作流程
1. 换液（Feeding）
目的：补充营养，清除代谢废物。
贴壁细胞：
1. 吸弃旧培养基（注意不要吸到细胞层）。
2. 加入预热的完全培养基。
悬浮细胞：
1. 将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm 离心 5 min。
2. 弃上清，用新鲜培养基重悬。
频率：一般 2–3 天一次，根据细胞密度和培养基颜色调整。
2. 传代（Passage）
当细胞达到 70–90% 汇合度时进行传代，以避免接触抑制和状态变差。
贴壁细胞（胰酶消化法）：
1. 弃上清，用 PBS 轻洗一次。
2. 加入适量 0.25%Trypsin-EDTA，37℃孵育 1–5 min，显微镜下观察细胞变圆、开始脱落。
3. 加入含血清的完全培养基终止消化。
4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液。
5. 离心，弃上清，重悬于新鲜培养基。
6. 按比例（如 1:3、1:5）接种到新的培养瓶中。
悬浮细胞：
- 直接按比例稀释到新的培养瓶中，必要时先离心去除死细胞和碎片。
3. 冻存与复苏
冻存步骤：
1. 收集对数生长期细胞，离心。
2. 用冻存液重悬（常用配方：培养基: 血清: DMSO =7:2:1 或 5:4:1，DMSO 5–10%）。
3. 分装入冻存管。
4. 放入程序降温盒，-80℃过夜，再转入液氮长期保存。
复苏步骤：
1. 从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴，1 min 内融化。
2. 立即加入大量预热的完全培养基，稀释DMSO。
3. 离心，弃上清。
4. 重悬，接种到培养瓶中。
5. 复苏后 24 h 内尽量不换液，让细胞恢复。
六、污染的识别与预防
1. 常见污染类型
细菌污染：
- 现象：培养基浑浊、变黄，显微镜下可见大量细小颗粒快速运动。
- 处理：通常直接丢弃，避免扩散。
真菌/酵母污染：
- 现象：培养基中出现絮状团块或丝状结构。
- 处理：直接丢弃，彻底清洁培养箱。
支原体污染：
- 现象：培养基外观正常，细胞生长变慢、形态异常。
- 危害：影响细胞代谢、基因表达和实验结果。
- 检测：PCR、qPCR、荧光染色等。
- 预防：定期检测，使用合格的血清和试剂，严格无菌操作。
七、细胞状态的日常监测
1. 每天观察：汇合度、形态、培养基颜色和是否有异常颗粒。
2. 记录：传代次数、冻存时间、使用的血清批次等，建立细胞档案。
3. 避免过度传代：细胞长期传代会出现基因型和表型漂移，建议使用早期代数。
八、实用小技巧
- 新拿到的细胞系，先查阅 ATCC、Cell Bank 等官方资料，了解其**培养条件。
- 同一细胞系尽量使用同一批次的血清和培养基，以保证实验的一致性。
- 建立“备份细胞库”，在细胞状态良好时多冻存几管，防止污染或状态变差时“断档”。
- 操作时保持耐心，避免“赶时间”导致的操作失误。